Γεννήθηκε και μεγάλωσε στη Ρώμη. Ο πατέρας του, Βιτσέντζο Λεόνε, ήταν από ένας τους πρώτους σκηνοθέτες του Ιταλικού κινηματογράφου (με το ψευδώνυμο Ρομπέρτο Ρομπέρτι) και η μητέρα του ηθοποιός. Άρχισε να δουλεύει στον κινηματογράφο σε ηλικία 18 ετών. Ξεκίνησε γράφοντας σενάρια στη δεκαετία του ’50 για τα επονομαζόμενα «πέπλα» (ψευδοϊστορικά έπη χαμηλού προϋπολογισμού) που ήταν εξαιρετικά δημοφιλή εκείνη την εποχή. Παράλληλα εργάστηκε σαν βοηθός σκηνοθέτη σε γνωστές Χολιγουντιανές παραγωγές που γυρίστηκαν στα περίφημα στούντιο της Τσινετσιτά, μεταξύ των οποίων τα Κβο Βάντις (1951) και Μπεν Χουρ (1959).
Στα πρώτα χρόνια της δεκαετίας του ’60 η απήχηση των ιστορικών επών εκφυλίστηκε, ο Λεόνε εντούτοις είχε την τύχη να βρίσκεται ανάμεσα στους πρωτοπόρους που ασχολήθηκαν με το ανερχόμενο τότε είδος των γουέστερν. Η ταινία του Για Μια Χούφτα Δολάρια υπήρξε μια από τις πρώτες (και πολύ επιτυχημένες) προσπάθειες στο είδος του «σπαγγέτι γουέστερν». Βασισμένο στο Ιαπωνικό ιστορικό έπος του Ακίρα Κουροσάβα, Yojimbo (1961), προκάλεσε νομικές διαμάχες με τον Ιάπωνα δημιουργό. Έμεινε επίσης στην ιστορία ως η ταινία που καθιέρωσε τον Κλιντ Ίστγουντ, έναν άγνωστο μέχρι τότε τηλεοπτικό ηθοποιό, σαν παγκόσμιο αστέρα.
Οι δύο επόμενες ταινίες του, Μονομαχία στο Ελ Πάσο (1965) και Ο Καλός, Ο Κακός και ο Άσχημος (1966), ολοκλήρωσαν την τριλογία, με την κάθε μια να είναι εμπορικά πιο επιτυχημένη και τεχνικά αρτιότερη από την προηγούμενη. Τη μουσική και στις τρεις αυτές ταινίες υπογράφει ο παραγωγικότατος συμπατριώτης του Λεόνε και θρύλος σήμερα της μουσικής, Ένιο Μορικόνε. Ο Λεόνε είχε αναπτύξει έναν πολύ ιδιαίτερο τρόπο κινηματογράφησης γύριζοντας τις σκηνές των ταινιών του με υπόκρουση την μουσική του Μορικόνε. Οι περισσότεροι κριτικοί συμφωνούν ότι Ο Καλός, Ο Κακός και ο Άσχημος ήταν η κορυφαία ταινία της τριλογίας.
Με εφαλτήριο την επιτυχία της τριλογίας του, το 1967 εκκλήθει στην Αμερική προκειμένου να σκηνοθετήσει αυτό που ήλπιζε να αποτελέσει το αριστούργημα του, το φιλόδοξο Κάποτε στη Δύση, για λογαριασμό της Paramount Pictures. Γυρισμένο ως επί το πλείστον σε Ισπανία και Ιταλία και εν μέρη στο Μόνιουμεντ Βάλεϊ της Γιούτα και με πρωταγωνιστές τους Χένρι Φόντα, Τσαρλς Μπρόνσον και Κλαούντια Καρντινάλε, αποτελούσε μια εκτεταμένη, συχνά βίαια και ονειρική φιλοσόφιση πάνω στη μυθολογία της Αμερικανικής Δύσης. Την ιστορία έγραψαν οι Μπερνάρντο Μπερτολούτσι και Ντάριο Αρτζέντο (με σημαντικές μετέπειτα καριέρες ως σκηνοθέτες) και το σενάριο υπέγραψε ο μακροχρόνιος φίλος και συνεργάτης του Λεόνε, Σέρτζιο Ντονάτι. Οι υπεύθυνου της Paramount ξαναμοντάρισαν το υλικό πριν τη διανομή του στις αίθουσες με αποτέλεσμα την εμπορική του αποτυχία στις Η.Π.Α. Στην Ευρώπη η ταινία έγινε επιτυχία και σήμερα θεωρείται από πολλούς ως η κορυφαία ταινία του δημιουργού.
Τα επόμενα χρόνια ο Λεόνε σκηνοθέτησε την ταινία A Fistful of Dynamite (1971), έκανε την παραγωγή σε έναν μικρό αριθμό ταινιών και δημιούργησε βραβευμένα τηλεοπτικά σποτ. Είχε απορρίψει την πρόταση να σκηνοθετήσει το Νονό για χάρη μιας άλλης γκανγκστερικής ιστορίας που είχε συλλάβει μερικά χρόνια πριν. Αφιέρωσε περισσότερα από δέκα χρόνια σε αυτή την παραγωγή που βασίζονταν στο βιβλίο του Harry Grey, “The Hoods” και εξιστορούσε τη ζωή τεσσάρων εβραϊκής καταγωγής γκάνγκστερ στη Νέα Υόρκη της εποχής του μεσοπολέμου. Το Κάποτε στην Αμερική (1984) με πρωταγωνιστές τους Ρόμπερτ Ντε Νίρο και Τζέημς Γουντς ήταν ακόμα μια φιλοσοφική ματιά πάνω σε έναν Αμερικανικό μύθο, το ρόλο της απληστίας και της βίας στη δύσκολη συνύπαρξη τους με έννοιες όπως εθνική καταγωγή και φιλία. Για μία ακόμη φορά το τελικό αποτέλεσμα κρίθηκε υπερβολικά μεγάλο σε διάρκεια και πολύ δηκτικό για τα στάνταρ του στούντιο, με αποτέλεσμα την δραστική περικοπή σκηνών (για την Αμερικανική αγορά μόνο) και την εμπορική αποτυχία. Στον υπόλοιπο κόσμο η ταινία προβλήθηκε χωρίς περικοπές στην πλήρη διάρκεια της (4 ώρες) και αποτέλεσε τόσο εμπορική όσο και καλλιτεχνική επιτυχία.
Τη χρονιά που πέθανε, το 1989, βρίσκονταν ήδη σε προχωρημένο στάδιο η προετοιμασία της επόμενης ταινίας του, ενός ιστορικού έπους που διαδραματίζονταν κατά τη διάρκεια της πολιορκίας του Λένινγκραντ στο Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο. Ο Λεόνε ήταν διαβόητος για την ακόρεστη όρεξη του, κάτι που τον οδήγησε στην παχυσαρκία, παράγοντας που πιθανότατα συντέλεσε στο θάνατο του από έμφραγμα του μυοκαρδίου. Αν και οι κριτικοί αρχικά δεν εκτίμησαν το έργο του, εξαιτίας της αρνητικής προκατάληψης απέναντι στα σπαγγέτι γουέστερν, σήμερα η αξία του Λέονε αναγνωρίζεται παγκοσμίως.
